Data:2020年12月15日 Click:0 Release:1
最近在Chem. Sci.上报道的一篇标题为 “A photocleavable peptide-tagged mass probe for chemical mapping of epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in human cancer cells” 的文章。该文的通讯作者是南京医科大学药学院的陈芸教授。陈芸课题组主要研究方向是基于液质联用(LC-MS)的蛋白质组学和基于生物标志物的靶向药物制备与机理研究等。
人表皮生长因子受体-2(HER2)具有胞外受体区、跨膜区和胞内酪氨酸激酶共三个区域。HER2多表达于乳腺癌、胃癌、前列腺癌等癌细胞上,是十分常见的肿瘤标志物。分析组织样品中HER2的分布及水平对于癌症诊断、治疗方案制定和预后均具有重要的临床价值。
临床表征组织样品最常用的技术是原位成像技术,例如主要用于检测蛋白过表达的免疫组织化学(IHC)技术和用于检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)技术。IHC技术主要是基于抗体的表征,但是抗体特异性各不相同,导致该方法难以标准化和绝对定量;FISH技术则耗时长、技术难度大,并且其基于DNA/mRNA的表征原理使其难以可靠预测蛋白丰度。目前,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)由于其高灵敏度、高选择性和定量能力,成为蛋白质组学的有力工具。而LC-MS/MS与原位成像分析联合用于生物标志物的检测,尚鲜有报道。陈芸课题组等人由此想到将LC-MS/MS与原位成像技术联用,以实现HER2分布及水平的定量化表征。
图1. 光裂解肽标记的质谱探针用于定位和定量HER2的示意图
作者设计了如图1所示的质谱探针。首先是特异性捕获HER2的部分,适配体HB5。适配体通常由单链DNA折叠成三级结构而具有特异性识别功能,具有合成方便、稳定性强的特点,是抗体的优秀替代品。然后,作者选择了FITC作为荧光成像基团。而针对定量的要求,作者延续使用了之前用于质谱定量的报告肽(Peptide)。质谱定量中常用酶促裂解以释放报告肽,但是酶促法有着酶稳定性不良、易导致假阳性、耗时长等缺点。因此,作者选用了邻硝基苄基衍生物接头(PL)来实现快速可控释放的光裂解法。且该接头裂解所需紫外光能量较低,对生物系统的危害更小。最终,形成HB5-FITC-PL-Peptide的质谱探针。
简而言之,作者设想这个质谱探针可以通过HB5特异性识别HER2并结合癌细胞,即可通过FITC荧光原位成像,而后在光裂解条件下释放报告肽通过LC-MS/MS进行定量表征。在具体合成上,作者通过在接头PL的基础上进行荧光基团FITC官能团化和报告肽的固相合成,以获得FITC-PL-Peptide,然后通过马来酰亚胺化再偶联适配体HB5,最终得到目标质谱探针HB5-FITC-PL-Peptide。
作为针对HER2分析的质谱探针,作者先进行了其对HER2的特异性和亲和力的表征。流式细胞仪结果(图2)显示,该探针与HER2阳性乳腺癌细胞(BT474和SK-BR-3)具有相对较强的结合能力,而与HER2阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7)具有较弱的结合亲和力。结果表现出质谱探针对HER2的高特异性。
图2. 光裂解肽标记的质谱探针可特异性定位HER2阳性癌细胞
并且,HER2阳性癌细胞在被HB5-FITC-PL-Peptide探针捕获后,通过探针上的FITC即可进行原位荧光的高分辨成像。定性成像结果与IHC结果吻合,也表明该探针对HER2的特异性和准确定位的能力。
在光裂解条件下,HB5-FITC-PL-Peptide探针释放质谱定量报告肽Peptide,通过和稳定同位素内标物在LC-MS/MS中峰面积的对比来定量HER2水平。在HER2表达水平高低不同的20种乳腺癌细胞中,该探针报告肽的定量水平与癌细胞上HER2表达水平成正比。结果表明定量限(LOQ)为25 pM,非常符合临床实验室测试的要求。并且,该探针显示出相比IHC技术更精细化、相比FISH技术更可靠的定量能力(图3)。
图3. 光裂解肽标记的质谱探针可对癌细胞HER2水平的定量化
总的来说,作者设计了一种通过光裂解释放质谱定量报告肽的HER2表征探针,同时实现了定性荧光高分辨成像和LC-MS/MS精确定量。它弥补了免疫组织化学(IHC)技术的半定量缺点和荧光原位杂交(FISH)技术的假阴性和操作繁琐等局限性。另外,探针设计中,报告肽的裂解方式不仅温和可控,而且裂解时间相比酶解法大大缩短,对临床诊断等具有重要意义。
参与文献
https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2020/SC/D0SC04481D
来源:吕华课题组