Data:2021年01月18日 Click:0 Release:1
脱酰胺化是指多肽或蛋白中天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)自发的非酶促脱酰胺基反应,是蛋白质降解的常见途径。在Asn脱酰胺的过程中形成五元环琥珀酰亚胺中间体,从不同方向水解会形成为天冬氨酸(Asn)和β-Asp(isoAsp)(Figure 1)。在肽和蛋白质老化过程中,脱酰胺位点从电中性转换为带负电,并在肽主链中形成β连接,导致蛋白质的结构和功能破坏。生理蛋白的脱酰胺作用与几种人类疾病有关,被认为是疾病的“计时器”。
近来,佐治亚州立大学的Peng GeorgeWang团队证明了无论是人为设计或者生理系统中自发的,N-连接的糖基化都具有防止糖蛋白和糖肽脱酰胺的作用(Figure 2),增加了肽和蛋白质的稳定性。
首先,作者从Uniprot数据库的糖蛋白中选择了五个肽作为研究目标。肽1a和GP 1(GlcNAcated peptides)的序列选自人α-1-酸性糖蛋白1,肽2a和GP 2的序列选自肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP10,肽3a、GP 3和GP 6的序列选自脱氧核糖核酸酶-2-α,肽4a和GP 4的序列选自sidekick-1蛋白,肽5a和GP 5的序列选自Smo蛋白同源物。这些肽的序列分别为NGT,NHT,NSS,NDS和NAT(Table 1)。
NGT序列在N+1位具有最小的位阻,脱酰胺速度最快。肽1a在孵育48h后仅剩下32.6%的未脱酰胺的肽,主要降解产物是由N端氨基与琥珀酰亚胺中间体反应得到的含二酮哌嗪的肽。通过计算得肽1a脱酰胺的半衰期为31小时;而在相同条件下孵育相应的糖肽GP 1 5天后,主峰仍然是原始的GP 1。在NHT,NSS和NDS序列中,N+1位的空间位阻较大,但组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基和天冬氨酸的羧酸基团对脱酰胺反应具有催化作用。肽2a,3a和4a的半衰期分别为6.4天,13天和13.2天,GP 2在相同条件下孵育5天后,HPLC的主峰仍然是GP 2的原始峰;GP 3在长达40天的孵育后,未观察到脱酰胺的产物;GP 4在孵育40天后虽然有新的峰产生,但并不是脱酰胺的产物峰。NAT序列比NGT具有更大的空间位阻,且甲基侧链没有催化作用,脱酰胺速度最慢。肽5a的脱酰胺半衰期为18.78天,而GP 5在孵育20天后没有显示出任何脱酰胺产物。以上结果都证明了多肽的糖基化降低了其脱酰胺速率,使之更稳定。此外,作者还证明了天然N-聚糖化的GP 6与单GlcNAc糖基化的GP 3具有相同的防止脱酰胺反应的功能(Figure 3)。
随后,作者以天然的糖蛋白RNaseB为底物,探究了N-聚糖对糖肽脱酰胺的预防作用。RNase B和RNase A含有相同的氨基酸序列并具有相似的生物学功能,它们之间的唯一区别是Asn34残基上的高甘露糖型N-糖基化。作者将RNase A在0.1 M甘氨酸-NaOH强碱性缓冲液中(pH = 9.6)78°C下孵育4天,以使酰胺反应更快进行,胰蛋白酶消化后对切割片段NLTK进行质谱分析。结果显示,绝大部分RNase A的Asn34残基发生了脱酰胺反应,NLTK转化为DLTK和IsoDLTK。而同样条件下将RNase B孵育4天,用Endo H除去第一个GlcNAc以外的高甘露糖型N-聚糖,消化后进行质谱分析,主峰仍为GlcNAcated Asn34,并没有脱酰胺峰。
作者将N-糖基化策略进一步用于稳定治疗性肽INGAP-P,该肽对1型和2型糖尿病都有治疗作用。INGAP-P的C末端存在NGS序列,在孵育40小时后仅存在60%的未脱酰胺的肽,计算得半衰期为55.9小时。而GlcNAc糖基化的INGAP-P(INGAP-P G1)和N-聚糖化的INGAP-P(INGAP-P G2)都比未经修饰的INGAP-P更稳定,在孵育30天后,HPLC结果只有原始的单峰。
由于研究表明INGAP肽可以刺激胰腺β细胞分泌胰岛素,作者进一步探究了修饰的INGAP肽对仓鼠胰岛素瘤细胞系HIT-T15中胰岛素分泌的影响。但结果显示,在基础水平和葡萄糖刺激条件下,对照组、未经修饰的INGAP-P肽以及糖基化的INGAP-P肽之间,胰岛素分泌没有显著差异。而用脱酰胺化的INGAP-P(INGAP-D)处理的细胞中胰岛素分泌出现一定的减少(Figure 7),这可能是由于其生物活性降低所导致。
综上,本文证明了在糖蛋白和糖肽中N-糖基化可以将脱酰胺率降到一个较低水平,但是当孵育时间延长到一定时间时,N-糖基化并不能使蛋白免受其他化学降解。该策略对于开发新的生物技术以增加肽和蛋白质药物的稳定性具有指导意义。
原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.0c00734